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什么是細胞外囊泡？
細胞外囊泡 (EV) 是由細胞分泌的膜結合小顆粒，被認為具有細胞信使的功能，將貨物從一個細胞運送到另一個細胞。電動汽車有多種亞型，其功能、貨物和尺寸各不相同，直徑范圍為 ~30-1000 nm。最小的 EV 類型是外泌體，大小約為 30-150 nm。EV 起源于稱為多泡體 (MVB) 的細胞區(qū)室，其本身源自內(nèi)體的內(nèi)陷。當 MVB 與質膜融合并釋放其貨物時，囊泡被釋放。
在生物醫(yī)學研究中，外泌體及其貨物被用作癌癥和其他疾病的診斷生物標志物。EV 和外泌體可以使用超速離心、PEG 沉淀和免疫捕獲珠等技術從血液或其他生物體液中分離出來。
外泌體膜含有源自原始細胞質膜的跨膜蛋白，通常包括四跨膜蛋白家族的蛋白質（如 CD9、CD63 和 CD81）。在內(nèi)部，外泌體包含細胞質成分，如蛋白質和 RNA?？梢允褂?/span> RNAseq、蛋白質印跡和流式細胞術等方法分析外泌體成分。為了通過流式細胞術進行表征，研究人員可以使用染料對膜和核酸等外泌體成分進行染色，以及與四跨膜蛋白或其他感興趣的蛋白質結合的抗體。
外泌體分析：小目標，大挑戰(zhàn)
外泌體的小尺寸使其難以處理和分析。在流式細胞術中，外泌體很難與細胞碎片和其他小顆粒區(qū)分開來，它們的大小處于或低于某些流式細胞儀的靈敏度極限。用某些染料或抗體染色有助于區(qū)分外泌體和其他顆粒。然而，使用不會形成聚集體的染色劑很重要，因為這些小顆粒本身可能會與染色的外泌體混淆。這種聚集體一直是外泌體研究人員的挫敗感。
在分析之前用于富集或純化 EV 的方法也是一個重要因素。富含簡單 PEG 沉淀步驟的樣品通常含有大量非 EV 脂質顆粒，這些顆粒也可能與膜染料結合。這些雜質可以通過使用其他 EV 純化方法來減少，例如尺寸排阻色譜 (SEC) 或免疫沉淀。與抗四跨膜蛋白抗體結合的磁珠可以產(chǎn)生純外泌體簇。然而，這些珠子可能會與許多疏水性染料（例如膜染料）非特異性結合。
我們已經(jīng)篩選了大量我們的抗體和染料，以尋找那些既能很好地染色外泌體，又表現(xiàn)出極少或沒有聚集（即在沒有外泌體的情況下發(fā)出信號）的抗體和染料。繼續(xù)閱讀下文，探索我們經(jīng)過驗證的 EV 抗體和染料。
EXOBRITE™ EV 膜染色試劑盒
ExoBrite™ EV 膜染色試劑盒旨在克服外泌體檢測的一些挑戰(zhàn)。ExoBrite™ 染料與外泌體膜中的分子結合，通過流式細胞術為分離的 EV 提供明亮、特異性的染色。ExoBrite™ 染料的一個關鍵優(yōu)勢在于，與許多其他染料不同，它們幾乎沒有或沒有與外泌體或 EV 大小相似的背景聚集體。此外，與大多數(shù)膜染料不同，ExoBrite™ 染料不會非特異性結合聚苯乙烯珠粒，這意味著它們可用于染色珠粒結合的外泌體。
ExoBrite™ EV 膜染色劑已在流式細胞術中得到驗證，能夠對來自多種不同培養(yǎng)細胞系的外泌體和 EV 進行染色，并通過多種不同方法進行分離，包括尺寸排阻色譜 (SEC)、聚乙二醇 (PEG) 沉淀和磁珠免疫沉淀 (IP)。
ExoBrite™ EV 膜染色優(yōu)點：
專為外泌體染色設計和配制
極低的背景可提供出色的信噪比
能夠與抗體共同染色（不同于 CellBrite® Fix 或 MemBrite® Fix）
能夠與珠結合外泌體一起使用（與大多數(shù)其他膜染料不同）
來自 MCF-7 細胞的珠結合外泌體的流式細胞術。未染色的外泌體（灰色）或與 10X ExoBrite™ 490/515 和 CD9(H19a)-CF®568（粉色）共染色。在 FITC 和 R-PE 通道中的 CytoFLEX LX 流式細胞儀上檢測到外泌體。
ExoBrite™ EV 膜染色/抗體共染色
ExoBrite™ EV 膜染色劑的一項優(yōu)勢是能夠與抗體共染色，用于外泌體蛋白質分析研究。共染色可以同時或順序進行，并且可以在純化的或珠結合的外泌體上進行。ExoBrite™ EV 膜染色劑是通用外泌體染色劑，應標記樣品中的所有外泌體*，允許使用抗體來量化表達目標蛋白質的外泌體數(shù)量。例如，在我們測試的外泌體（MCF-7 衍生）中，四跨膜蛋白 CD9 高度且無處不在地表達。** 我們發(fā)現(xiàn)，當我們與 ExoBrite™ 560/585 EV Membrane Stain 和 CD9（ H19a)-CF®488A，它們的陽性群體幾乎*重疊（見圖，右）。
純化外泌體最佳 ExoBrite™/抗體共染色的提示：
使用 10X ExoBrite™ 對 1 mL 中純化的外泌體進行染色（ExoBrite™ 染色在同時共染色期間會有所減少，因此不建議使用 1X）
嘗試從至少 0.1 ug/mL 的抗體開始
*在我們測試的外泌體中，ExoBrite™ EV 膜染色劑標記了所有外泌體?？赡艽嬖诰哂胁煌旧降耐饷隗w類型。
**四跨膜蛋白（CD9、CD61 和 CD81）和其他蛋白質的表達水平在細胞類型和外泌體來源之間差異很大。
SEC 純化的 MCF-7 衍生外泌體同時使用 1 mL 10X ExoBrite™ 560/585 EV Membrane Stain 和 0.1 ug/mL CD9(H19a)-CF®488A 染色。當對 ExoBrite™ 560/585 陽性顆粒進行門控時，約 95% 的 CD9 也呈陽性（頂行）。同樣，當對 CD9 陽性顆粒進行門控時，約 95% 的 ExoBrite™ 560/585 也呈陽性（底行）
經(jīng)驗證的外泌體抗體
用作外泌體標志物的最常見蛋白質是四跨膜蛋白家族的成員 CD9、CD63 和 CD81。四跨膜蛋白是具有許多擬議功能的質膜蛋白，包括其他膜蛋白的活化和分選。它們還被認為在將蛋白質靶向多泡體 (MVB) 和外泌體方面發(fā)揮作用。這些四跨膜蛋白在許多細胞類型上廣泛表達，因此可以在許多類型的外泌體上檢測到，但它們的表達水平確實因細胞來源類型而異。
EV 中經(jīng)常檢測到的其他蛋白質包括熱休克蛋白（即 HSP70）、膜運輸?shù)鞍住?/span>MVB 生物發(fā)生蛋白（即 Alix、TSG101）和細胞粘附分子（即 Ep-CAM、ICAM-1）。Ep-CAM 主要在上皮細胞中表達，包括細胞系 MCF-7。
Biotium 提供多種不同的針對外泌體標記蛋白的抗體克隆，每種都有多種偶聯(lián)物選擇，例如亮 CF® 染料和生物素。下面列出的抗體已通過流式細胞術專門驗證用于外泌體檢測，使用富集的 MCF-7 衍生的 EV，結合 CD63 特異性磁珠 (Thermo Fisher Scientific)。
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