甲基化特異性MLPA

(MS-MLPA) 是SALSA® ^MLPA®^{技術(shù)的一種變體。通過MS-MLPA，可以同時(shí)對(duì)多個(gè)目標(biāo)進(jìn)行半定量的甲基化分析。}

MS-MLPA 探針

如同常規(guī)MLPA探針混合物，MS-MLPA探針混合物包含靶向特定基因組序列的探針。每個(gè)探針由兩部分組成：左探針寡核苷酸（LPO）和右探針寡核苷酸（RPO）。MS-MLPA探針混合物中的某些探針靶向包含甲基化敏感性HhaI內(nèi)切酶限制位點(diǎn)的區(qū)域。這些探針可用于甲基化分析。

MS-MLPA 的原理

探針與樣品DNA上的目標(biāo)序列雜交。然后使用HhaI酶消化未甲基化的雙鏈探針-DNA復(fù)合物。

與未甲基化樣本DNA形成的復(fù)合物被消化。消化后的探針無法呈指數(shù)級(jí)擴(kuò)增，因此不會(huì)產(chǎn)生信號(hào)。與甲基化樣本DNA形成的復(fù)合物不被HhaI消化，并將產(chǎn)生正常信號(hào)。

MS-MLPA 反應(yīng)

MS-MLPA 的步驟與MLPA的步驟非常相似。最重要的區(qū)別是反應(yīng)在過夜雜交后被分為未消化和已消化的反應(yīng)。

未消化的反應(yīng)用于拷貝數(shù)測(cè)定。在消化的反應(yīng)中，用于甲基化分析，HhaI酶與Ligase-65酶同時(shí)加入。

數(shù)據(jù)分析

 用于分析數(shù)據(jù)。拷貝數(shù)與常規(guī) MLPA 一樣，通過未消化反應(yīng)來確定。DNA 樣本中的甲基化百分比是通過將消化反應(yīng)中的每個(gè)探針信號(hào)與未消化反應(yīng)中的相應(yīng)信號(hào)進(jìn)行比較來確定的。

完成

對(duì)您的MLPA數(shù)據(jù)進(jìn)行完整分析。

質(zhì)量

對(duì)您的樣品和實(shí)驗(yàn)進(jìn)行嚴(yán)格的質(zhì)控。

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* 歐盟（候選）成員國(guó)、歐洲自由貿(mào)易聯(lián)盟（EFTA）成員和英國(guó)。

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Coffalyser 允許您以多種方式可視化和分析您的數(shù)據(jù)。您可以查看電泳圖、表格，或者關(guān)注帶有拷貝數(shù)比率的圖表。對(duì)于更復(fù)雜的病例和故障排除，您可以查看中間分析步驟的結(jié)果。要討論或存儲(chǔ)您的結(jié)果，您可以將總結(jié)導(dǎo)出為 PDF。

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關(guān)于我們的產(chǎn)品的最新信息可以直接從Coffalyser內(nèi)部從我們的服務(wù)器獲取。這確保了您在收到新產(chǎn)品后即可開始分析。Coffalyser的更新始終是免費(fèi)的，確保您始終從最新的見解中受益。

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# 附錄I-標(biāo)準(zhǔn)化和結(jié)果解釋

MLPA是一種基于探針信號(hào)相對(duì)變化分析的相對(duì)技術(shù)。MLPA探針的絕對(duì)熒光信號(hào)強(qiáng)度（由毛細(xì)管電泳儀測(cè)量）在用于數(shù)據(jù)分析之前需要進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

## 標(biāo)準(zhǔn)化

 拷貝數(shù)分析

Coffalyser使用一系列標(biāo)準(zhǔn)化步驟和計(jì)算來計(jì)算最終探針比率。在稱為內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)化的過程中，Coffalyser通過將探針信號(hào)與一個(gè)樣本中的參考探針信號(hào)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，將絕對(duì)信號(hào)強(qiáng)度轉(zhuǎn)換為相對(duì)值。這對(duì)每個(gè)樣本都進(jìn)行。在相互標(biāo)準(zhǔn)化期間，Coffalyser將每個(gè)樣本與參考樣本進(jìn)行比較。

標(biāo)準(zhǔn)化過程的簡(jiǎn)化版本如下：

步驟1 

將樣本1中目標(biāo)探針1（Tp1）的信號(hào)強(qiáng)度除以參考探針1（Rp1）的信號(hào)強(qiáng)度。在參考樣本1中進(jìn)行相同操作。然后將第一個(gè)值除以第二個(gè)值。

這對(duì)探針混合物中包含的每個(gè)參考探針都進(jìn)行。這導(dǎo)致目標(biāo)探針1的中間比率數(shù)量與探針混合物中的參考探針數(shù)量相同。接下來，取這些中間比率的中值。見下面的等式。

步驟2 

使用分析中包含的每個(gè)參考樣本重復(fù)步驟1。這導(dǎo)致樣本1中目標(biāo)探針1的中值數(shù)量與分析中的參考樣本數(shù)量相同。

Coffalyser然后計(jì)算這些中值的平均值。這產(chǎn)生樣本1中目標(biāo)探針1的最終比率。

這個(gè)過程對(duì)所有探針重復(fù)（除了突變特異性探針和信號(hào)非常低的探針，見第34頁的“最終比率與內(nèi)部比率百分比"部分）。

 分析中未定義參考樣本

當(dāng)分析中未定義參考樣本時(shí)，所有樣本都用于標(biāo)準(zhǔn)化。這將導(dǎo)致一個(gè)探針的中值數(shù)量與樣本數(shù)量相同。這些中值的中值是樣本中一個(gè)探針的最終比率。這個(gè)過程對(duì)所有探針和樣本重復(fù)。

 更多信息

Coffalyser中用于MLPA數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化的確切程序和算法已由Coffalyser的開發(fā)人員描述（Jordy Coffa和Joost van den Berg（2011）。MRC-Holland的新型軟件Coffalyser分析MLPA數(shù)據(jù)，《現(xiàn)代質(zhì)量控制方法》，Ahmed Badr Eldin博士（編輯），InTech，

 甲基化特異性MLPA分析

MS-MLPA數(shù)據(jù)的分析分為兩部分。第一部分通過將未消化的患者樣本標(biāo)準(zhǔn)化為未消化的參考樣本來確定拷貝數(shù)，就像拷貝數(shù)分析一樣。第二部分確定樣本的甲基化狀態(tài)。這通過將消化樣本與其未消化的對(duì)應(yīng)物進(jìn)行比較來完成。

簡(jiǎn)化來說，標(biāo)準(zhǔn)化的第二部分工作如下：

將消化樣本1中目標(biāo)探針1（Tp1）的信號(hào)強(qiáng)度除以參考探針1（Rp1）的信號(hào)強(qiáng)度。在未消化樣本1中進(jìn)行相同操作。然后將第一個(gè)值除以第二個(gè)值。

這對(duì)探針混合物中包含的每個(gè)參考探針都進(jìn)行，這將導(dǎo)致目標(biāo)探針1的中間比率數(shù)量與探針混合物中的參考探針數(shù)量相同。接下來，取這些中間比率的中值。見下面的等式。

這個(gè)過程對(duì)所有探針重復(fù)（除了突變特異性探針和信號(hào)非常低的探針，見第34頁的“最終比率與內(nèi)部比率百分比"部分）。

結(jié)果和解釋

 重要提示：

以下結(jié)果應(yīng)始終在大小調(diào)用峰圖和/或原始運(yùn)行數(shù)據(jù)中目視確認(rèn)：

- 純合缺失

- 單個(gè)探針缺失和增益

- MS-MLPA結(jié)果

- 鑲嵌現(xiàn)象

- 異常和意外結(jié)果

建議也目視確認(rèn)其他結(jié)果，但這不是必需的。

 拷貝數(shù)分析

 95%置信區(qū)間

除了計(jì)算探針比率外，Coffalyser還使用統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)來確定結(jié)果是否可靠。為此，它為每個(gè)探針計(jì)算參考樣本的95%置信區(qū)間。這表示在100個(gè)參考樣本中，預(yù)計(jì)有95個(gè)樣本的探針比率落在該范圍內(nèi)。參考樣本上探針的95%置信區(qū)間在比率圖中描繪為彩色條（見圖1）。

此外，它還為樣本中的每個(gè)探針計(jì)算95%置信區(qū)間估計(jì)。這表示在100次對(duì)該樣本的實(shí)驗(yàn)中，預(yù)計(jì)有95次實(shí)驗(yàn)的探針比率落在該范圍內(nèi)。樣本中探針的95%置信區(qū)間在比率圖中描繪為圍繞計(jì)算的探針比率的誤差條，該比率表示為一個(gè)點(diǎn)（見圖2）。

當(dāng)這兩個(gè)95%置信區(qū)間不重疊時(shí)，可以高度確定地得出樣本中的結(jié)果與參考樣本顯著不同的結(jié)論。如果存在重疊，結(jié)果不太明確，因此不能得出結(jié)果與參考樣本不同的結(jié)論。

 任意邊界

Coffalyser還在比率圖中顯示任意邊界，為紅色（下任意邊界）和藍(lán)色（上任意邊界）線。默認(rèn)情況下，邊界設(shè)置為參考樣本上探針平均值的±0.3（在比率圖中用黃色“x"表示）。例如，當(dāng)參考樣本上探針的平均值為0.95時(shí)，下任意邊界設(shè)置為0.65（0.95-0.3），上任意邊界設(shè)置為1.25（0.95+0.3）。由于參考樣本上探針的平均值對(duì)于每個(gè)探針都是不同的（并非所有探針的比率都是1），因此任意邊界不是直線。

當(dāng)探針比率跨越這些邊界時(shí)，這表明存在重復(fù)或缺失（假設(shè)探針靶向的序列的正?？截悢?shù)為2）。然而，跨越任意邊界并不一定意味著探針的目標(biāo)序列確實(shí)被刪除或重復(fù)！例如，同一探針在參考樣本上的95%置信區(qū)間也可能跨越任意邊界。在這種情況下，樣本中的探針結(jié)果可能與參考樣本沒有不同。

顯示結(jié)果

提供了在網(wǎng)格、比率圖和PDF報(bào)告中顯示探針結(jié)果的可能性。圖3概述了可能的探針結(jié)果以及它們?cè)?span>Coffalyser的不同區(qū)域中如何顯示。

情況1： 探針結(jié)果不表明拷貝數(shù)變化：在PDF報(bào)告中，比率為黑色字體，[REF]列中顯示等號(hào)（=），網(wǎng)格中顯示灰色或綠色單元格（目標(biāo)探針）和黃色單元格（參考探針）。在比率圖中，探針的95%置信區(qū)間估計(jì)與同一探針在參考樣本上的95%置信區(qū)間重疊（藍(lán)色框）。

情況2： 探針結(jié)果表明與參考樣本相比信號(hào)顯著降低，因?yàn)橛?jì)算出的降低超過兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差。在PDF報(bào)告中，比率為斜體，黑色字體。在[REF]列中，這由兩個(gè)小于括號(hào)（<<）表示。在網(wǎng)格中，單元格為紫色，表示未跨越下任意邊界。在比率圖中，誤差條與同一探針在參考樣本上的95%置信區(qū)間不重疊（藍(lán)色框）。

情況3： 探針結(jié)果表明與參考樣本相比信號(hào)顯著增加，因?yàn)橛?jì)算出的增加超過兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差。在PDF報(bào)告中，比率為斜體，黑色字體。在[REF]列中，這由兩個(gè)大于括號(hào)（>>）表示。在網(wǎng)格中，單元格為紫色，表示未跨越上任意邊界。在比率圖中，誤差條與同一探針在參考樣本上的95%置信區(qū)間不重疊（藍(lán)色框）。

情況4： 探針結(jié)果表明雜合缺失（假設(shè)探針通常靶向兩個(gè)拷貝）。計(jì)算出的降低超過兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差，并且跨越了下任意邊界。在PDF報(bào)告中，比率為粗體和斜體，紅色字體。在[REF]列中，這由兩個(gè)帶星號(hào)的小于括號(hào)（<<*）表示。在網(wǎng)格中，單元格為亮紅色。在比率圖中，誤差條與同一探針在參考樣本上的95%置信區(qū)間不重疊（藍(lán)色框），并且探針比率跨越下任意邊界（紅線）。

情況5： 探針結(jié)果表明雜合重復(fù)（假設(shè)探針通常靶向兩個(gè)拷貝）。計(jì)算出的增加超過兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差，并且跨越了上任意邊界。在PDF報(bào)告中，比率為粗體和斜體，藍(lán)色字體。在[REF]列中，這由兩個(gè)帶星號(hào)的大于括號(hào)（>>*）表示。在網(wǎng)格中，單元格為深藍(lán)色。在比率圖中，誤差條與同一探針在參考樣本上的95%置信區(qū)間不重疊（藍(lán)色框），并且探針比率跨越上任意邊界（藍(lán)線）。

情況6： 探針結(jié)果表明與參考樣本相比信號(hào)非顯著降低，因?yàn)閮H計(jì)算出一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差的降低。然而，跨越了下任意邊界。在PDF報(bào)告中，比率為粗體和斜體，紅色字體。在[REF]列中，這由一個(gè)帶星號(hào)的小于括號(hào)（<*）表示。在網(wǎng)格中，單元格為淺紅色。在比率圖中，誤差條與同一探針在參考樣本上的95%置信區(qū)間重疊（藍(lán)色框），并且探針比率跨越下任意邊界（紅線）。

情況7： 探針結(jié)果表明與參考樣本相比信號(hào)非顯著增加，因?yàn)閮H計(jì)算出一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差的增加。然而，跨越了上任意邊界。在PDF報(bào)告中，比率為粗體和斜體，藍(lán)色字體。在[REF]列中，這由一個(gè)帶星號(hào)的大于括號(hào)（>*）表示。在網(wǎng)格中，單元格為淺藍(lán)色。在比率圖中，誤差條與同一探針在參考樣本上的95%置信區(qū)間重疊（藍(lán)色框），并且探針比率跨越上任意邊界（藍(lán)線）。

情況8： 探針結(jié)果不確定，盡管（在這種情況下）跨越了下任意邊界。在PDF報(bào)告中，比率為斜體，棕色字體。在[REF]列中，這由問號(hào)（?）表示。在網(wǎng)格中，單元格為白色。在比率圖中，探針比率點(diǎn)為黃色。

情況9： 探針結(jié)果表明一種奇怪的、不常見的情況，其中大多數(shù)參考樣本對(duì)該探針沒有信號(hào)。比率是基于有信號(hào)的參考樣本計(jì)算的，這是危險(xiǎn)的。這種情況最常出現(xiàn)在特殊探針混合物中，當(dāng)不使用專用參考樣本時(shí)，和/或當(dāng)選擇了不正確的參考樣本時(shí)。在PDF報(bào)告中，比率為斜體，棕色字體。在[REF]列中，這由術(shù)語INF表示。在網(wǎng)格中，單元格為橙色。在比率圖中，探針比率點(diǎn)為橙色。

情況10： 探針結(jié)果表明未找到信號(hào)。在PDF報(bào)告中，比率為粗體和斜體，紅色字體。在[REF]列中，這由兩個(gè)帶兩個(gè)星號(hào)的小于括號(hào)（<<）表示。在網(wǎng)格中，單元格為黃色。在比率圖中，探針比率點(diǎn)為紅色。

注意： 在上述情況中，假設(shè)參考樣本上探針的平均值為1.0。

分析

盡管在MS-MLPA分析中為每個(gè)探針計(jì)算了甲基化比率，但只有甲基化特異性探針（包含HhaI位點(diǎn)）的比率指示樣本的甲基化狀態(tài)。在Coffalyser中，這些探針在其名稱中標(biāo)記有[HhaI]。

計(jì)算的甲基化特異性探針的甲基化比率指示樣本中甲基化的拷貝數(shù)。因此，要了解樣本中探針的甲基化狀態(tài)，了解其拷貝數(shù)很重要。表1列出了一些示例。

拷貝數(shù)分析 甲基化狀態(tài)分析

最終比率拷貝數(shù)甲基化結(jié)果甲基化拷貝數(shù)

為了確定獲得的結(jié)果是否表明異常，應(yīng)將其與參考樣本的結(jié)果進(jìn)行比較，預(yù)計(jì)參考樣本在感興趣區(qū)域具有正常的拷貝數(shù)和甲基化狀態(tài)。

Coffalyser為每個(gè)探針的甲基化狀態(tài)計(jì)算參考樣本的95%置信區(qū)間（圖5中下部比率圖中的藍(lán)色框）。這表示在100個(gè)參考樣本中，預(yù)計(jì)有95個(gè)樣本的探針甲基化值落在該范圍內(nèi)。還為樣本中的每個(gè)探針計(jì)算95%置信區(qū)間估計(jì)，這表示在100次對(duì)該樣本的實(shí)驗(yàn)中，預(yù)計(jì)有95次實(shí)驗(yàn)的探針甲基化狀態(tài)落在該范圍內(nèi)（圖5中下部比率圖中與探針結(jié)果相關(guān)的誤差條）。

 任意邊界

Coffalyser還在拷貝數(shù)和甲基化比率圖中顯示任意邊界，為紅色（下任意邊界）和藍(lán)色（上任意邊界）線。默認(rèn)情況下，邊界設(shè)置為參考樣本上探針平均值的±0.3。例如，當(dāng)參考樣本上探針的平均值為0.95時(shí)，下任意邊界設(shè)置為0.65（0.95-0.3），上任意邊界設(shè)置為1.25（0.95+0.3）。在甲基化圖中，參考樣本上探針的平均值對(duì)于每個(gè)探針都是不同的（例如，由于HhaI限制位點(diǎn)的存在、實(shí)驗(yàn)變異），因此任意邊界不是直線。

當(dāng)探針的甲基化狀態(tài)跨越這些邊界時(shí)，這表明與參考樣本相比甲基化狀態(tài)存在差異。然而，跨越任意邊界并不一定意味著探針的目標(biāo)序列的甲基化狀態(tài)確實(shí)異常！例如，同一探針在參考樣本上的95%置信區(qū)間也可能跨越任意邊界。在這種情況下，樣本中的探針結(jié)果可能與參考樣本沒有不同。

 在Coffalyser中顯示結(jié)果

在比較分析實(shí)驗(yàn)資源管理器中，Coffalyser默認(rèn)將樣本的未消化和消化對(duì)應(yīng)物的結(jié)果直接相鄰顯示（見圖4）。

在比較分析樣本結(jié)果資源管理器的比率圖選項(xiàng)卡中，Coffalyser通常顯示兩個(gè)比率圖。對(duì)于所選樣本，上部圖表顯示未消化對(duì)應(yīng)物的結(jié)果，即拷貝數(shù)分析，下部圖表顯示MLPA反應(yīng)的消化對(duì)應(yīng)物的結(jié)果，即甲基化狀態(tài)分析（見圖5）。

也可以比較分析實(shí)驗(yàn)資源管理器的比率概述選項(xiàng)卡和比較分析樣本結(jié)果資源管理器的比率圖選項(xiàng)卡中分別查看未消化或消化樣本的結(jié)果。

程序：更改比較分析實(shí)驗(yàn)資源管理器的比率概述選項(xiàng)卡中的結(jié)果顯示

1. 在比較分析實(shí)驗(yàn)資源管理器的RATIO OVERVIEW選項(xiàng)卡中，右鍵單擊并選擇Show Data Type。

2. 從出現(xiàn)的列表中選擇DNA或MS，分別僅顯示未消化樣本或消化樣本的結(jié)果。

3. 要再次查看組合結(jié)果，請(qǐng)按照步驟1和2并選擇DNA/MS。

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