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在我們實(shí)驗(yàn)室分發(fā)細(xì)胞壁單克隆抗體超過20年之后，PlantProbes 的活動(dòng)在2021年6月底停止了。我們感謝各地的研究人員對我們的細(xì)胞壁抗體所表現(xiàn)出的興趣，我們很高興它們繼續(xù)有用?？贵w特異性和出版物鏈接抗體將繼續(xù)從其他來源獲得，包括 Kerafast、 Megazyme 和 Ximbio。褐藻多糖和藻酸鹽的 BAM 抗體可以在羅斯科夫的 SeaProbes 上買到。目前正在探索選擇這些試劑的其他途徑。JIM 和 MAC 抗體的選擇(AGPs/伸展蛋白)也可以從 CCRC/佐治亞大學(xué)的 Carbosource 獲得。如果你對 CBMs 感興趣，請注意里斯本的 NZYTech 有大量具有廣泛特異性的 CBMs。我們的抗體探針的概述列表和簡短指南我們的細(xì)胞壁抗體是高度敏感的，高度特異性和通用的分子工具，可用于顯微鏡分析和定量評(píng)估所有植物材料中的細(xì)胞壁聚合物，從水果和蔬菜到纖維和所有形式的植物生物量。我們很樂意討論探針的任何潛在用途或應(yīng)用。任何關(guān)于我們抗體的詢問，請聯(lián)系 Paul Knox
細(xì)胞壁聚合物探針的產(chǎn)生我們的研究目標(biāo)之一是產(chǎn)生用于原位分析細(xì)胞壁聚糖的特定探針。針對寡糖表位的單克隆抗體等探針是分析植物細(xì)胞壁多糖在生命周期中的時(shí)空分布及其修飾的重要工具。此外，它們是確定聚合物排列和單個(gè)細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的必要工具。我們的探針一般是大鼠雜交瘤單克隆抗體。我們還探索了來自細(xì)胞壁水解酶的重組組氨基酸標(biāo)記的碳水化合物結(jié)合模塊(CBMs)作為細(xì)胞壁組分的探針以類似于抗體的方式起作用的能力。聚糖單克隆抗體的產(chǎn)生并不簡單。其局限性包括聚糖的低免疫原性，這往往需要制備新糖蛋白免疫原。這涉及到一個(gè)確定的寡糖偶聯(lián)到一個(gè)免疫原性蛋白，如 BSA 或 KLH。這一策略導(dǎo)致了1,4-半乳聚糖，1,4-木聚糖，1,5-阿拉伯聚糖，1,4-甘露聚糖和木葡聚糖單克隆抗體的產(chǎn)生。一個(gè)復(fù)合因素是適當(dāng)定義的寡糖的有限可用性，這些寡糖既是與蛋白質(zhì)和免疫原制備的偶聯(lián)所必需的，也是衍生抗體的角色塑造所必需的。我們參與生成的單克隆抗體的清單以及目前如何獲得樣品的細(xì)節(jié)可以在這里找到: 抗體。
我們的大鼠單克隆抗體以雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液的形式獲得，這些上清液含有(0.05% w/v)作為防腐劑。它們可以儲(chǔ)存在4攝氏度，在那里它們將保持活躍多年。它們可以被冷凍，但應(yīng)避免重復(fù)的冷凍/解凍周期。所述抗體在含有阻斷蛋白如牛奶蛋白或 BSA 的 PBS (磷酸鹽緩沖鹽水)中用作10倍至100倍的稀釋液。所有二級(jí)檢測抗體也應(yīng)在此緩沖液中適當(dāng)稀釋。抗體孵育的每個(gè)階段應(yīng)進(jìn)行至少1小時(shí)。培養(yǎng)大多在室溫下進(jìn)行，而 O/N 培養(yǎng)可在4 °C 下進(jìn)行。LM 和 JIM 系列單克隆抗體是 RAT 單克隆抗體，需要抗大鼠 IgG (全分子)二級(jí)試劑。使用我們的抗體/CBMs 在生物原型 Cornuault V，Knox JP (2014)三明治 ELISA 分析植物細(xì)胞壁聚糖連接的新方案。使用大鼠單克隆抗體在..。
免疫標(biāo)記技術(shù)免疫熒光抗體免疫標(biāo)記方法概述通過在磷酸鹽緩沖鹽水(MP/PBS)中與3% (w/v)牛奶蛋白孵育至少30分鐘，阻斷制備的細(xì)胞或粘附在玻片上的植物材料的非特異性結(jié)合位點(diǎn)。用稀釋于 MP/PBS 中的大鼠單克隆抗體在室溫下孵育至少1小時(shí)或在攝氏4度下孵育過夜。將雜交瘤上清液稀釋五倍是獲得第一抗體的良好起點(diǎn)。用三次 PBS 洗滌，每次洗滌至少5分鐘。與在 MP/PBS 中100倍稀釋的第二抗體一起在 RT 培養(yǎng)1小時(shí)。我們使用與 FITC (Sigma)清洗連接的抗大鼠 IgG (全分子)與三種 PBS 變化，每種變化至少5分鐘。使用防褪色試劑裝載載玻片并檢查。我們使用花旗熒光甘油為基礎(chǔ)的抗褪色切片。免疫金標(biāo)記抗體免疫標(biāo)記方法概述通過將 EM 網(wǎng)格切片側(cè)面漂浮在3% (w/v)牛血清白蛋白在磷酸鹽緩沖鹽水(BSA/PBS)中的液滴(至少20ml)上防止非特異性結(jié)合在 Parafilm 上30分鐘。轉(zhuǎn)移網(wǎng)格到 BSA/PBS 稀釋液滴中的一抗。單克隆抗體應(yīng)在5倍和100倍之間稀釋。通過至少三種 PBS 變化的溫育來洗滌柵格。將柵格轉(zhuǎn)移到用 BSA/PBS 稀釋20分之一的二抗。我們使用與10nm 金(Sigma)偶聯(lián)的抗大鼠 IgG。像步驟3那樣洗，然后在蒸餾水中廣泛地洗。讓網(wǎng)格干燥，然后用電子顯微鏡檢查。2022年利茲大學(xué)，利茲，LS29JT 條款和條件版權(quán)無障礙隱私和 Cookie
基于硝酸纖維素的免疫化學(xué)測定和免疫印刷免疫點(diǎn)測定/組織印刷方法概述通過用軟鉛筆仔細(xì)劃線，在適當(dāng)大小的硝酸纖維素膜(Schleicher & Schuell)上標(biāo)出測定位點(diǎn)。我們使用5毫米 x 5毫米正方形。將1μl 溶于水或適當(dāng)緩沖液中的試驗(yàn)化合物等分試樣施加于硝化纖維素上，并晾干1小時(shí)。使用稀釋級(jí)數(shù)是有用的?；蛘撸谱髑衅参锊牧系慕M織印刷或制作顯示根系的印刷以研究多糖分泌物。用3% (w/v)乳蛋白在磷酸鹽緩沖鹽水(MP/PBS)中孵育1小時(shí)以阻斷所有結(jié)合位點(diǎn)。在第一抗體中培養(yǎng)1.5小時(shí)。大鼠雜交瘤上清液在 MP/PBS 中稀釋至少10倍。在大多數(shù)情況下，我們發(fā)現(xiàn)自來水可以作為 PBS 的合適替代品。將抗大鼠 IgG (全分子)與辣根過氧化物酶(HRP) ，Sigma)在 MP/PBS 中稀釋1000倍的區(qū)域中孵育1.5小時(shí)。在 PBS 中大量洗滌。參見步驟4。通過在使用前立即制備的酶標(biāo)記底物(例如 HRP 底物: 25ml 去離子水，含10mg/ml 4-氯 -1-萘酚的5ml 甲醇，30μl6% (v/v)過氧化氫)中溫育，確定抗體與硝化纖維素的結(jié)合。在使用前立即制備) ，并容許。當(dāng)黑點(diǎn)出現(xiàn)在抗原位點(diǎn)時(shí)，通過在自來水中大量清洗來停止反應(yīng)。微量滴定板法(ELISA)抗體捕獲方法概述 ELISA 將用作固定抗原的樣本調(diào)整至50mM 碳酸，pH9.6，濃度為 c.50 μg/ml。向微量滴定板的適當(dāng)孔中加入100μl 抗原，并在4 °C (或 RT 時(shí)2小時(shí))溫育過夜。具有無抗原的孔對于確定無抗體結(jié)合的信號(hào)是有用的。用洗滌法去除含有抗原的溶液。用200μl/孔3% (w/v)牛血清白蛋白在磷酸鹽緩沖鹽水(BSA/PBS)中，在室溫下或在4 °C 時(shí)用 O/N 封閉平板上的所有結(jié)合位點(diǎn)2小時(shí)。用 PBS 洗盤子。最容易做到這一點(diǎn)的方法是將盤子反復(fù)浸入裝滿 PBS 的托盤中，搖晃，然后強(qiáng)行將 PBS 扔出(扔進(jìn)水槽)。這句話重復(fù)了十次。在我們的手中，自來水往往可以是一個(gè)合適的替代洗滌介質(zhì)。在適當(dāng)稀釋的 BSA/PBS 中加入100μl/孔的一抗至少1.5小時(shí)。作為指導(dǎo)，將大鼠雜交瘤上清液稀釋10倍，然后稀釋5或10倍。按步驟5洗盤子15次。加入100μl/孔的第二抗體(例如抗大鼠 IgG (整個(gè)分子)偶聯(lián)至辣根過氧化物酶(HRP) ，Sigma) ，在 BSA/PBS 中稀釋1000倍。孵育至少1.5小時(shí)。按步驟5洗盤子15次。通過加入使用前立即制備的150μl/孔 HRP 底物(18ml 去離子水，2ml 1M 醋酸鈉緩沖液 pH6.0,200μl 四甲基聯(lián)苯，20μl 6% (v/v)過氧化氫)來確定抗體與平板的結(jié)合。加入50μl/孔的2.5 M 硫酸可停止顯色。吸光度測定在450納米在微板讀數(shù)器。抗體滴定曲線圖。A在第二種類型的競爭抑制 ELISA 中，抗原-抗體相互作用的定量*處于可溶性階段。競爭抑制 ELISA 可以對所有抗原進(jìn)行非常靈敏的定量分析。這是一個(gè)特別適合的技術(shù)，以測定抗體結(jié)合半抗原或小分子，不能有效地堅(jiān)持微量滴定板。競爭抑制 ELISA 必須分兩個(gè)步驟進(jìn)行，如圖 A 和圖 B 所示。首先，使用抗體捕獲 ELISA 和抗體針對恒定水平的固定抗原的滴定來確定抗體的工作稀釋度(見上文和圖1)。答)。在第二步中使用提供90% 最大結(jié)合力的抗體稀釋法，因?yàn)樵谶@種稀釋法中，抗體結(jié)合對抑制作用最敏感。通過存在可溶性抗原或半抗原來抑制與固定化抗原結(jié)合的這種水平的抗體，如下所述和如下圖所示費(fèi)格。競爭抑制 ELISA 半抗原滴定曲線方法綜述。用抗原(固定的抗原)包被微量滴定板并用 BSA/PBS 封閉。確定在抗體捕獲 ELISA 中與該抗原最大結(jié)合的90% 的一級(jí)抗體稀釋度(x)(參見上文和圖1)。答)。在微量滴定板的適當(dāng)孔中加入50μl/孔的連續(xù)稀釋的可溶性抗原或 PBS 中的半抗原。作為指導(dǎo)，從2毫克/毫升開始，準(zhǔn)備10倍稀釋液。在 BSA/PBS 的第3步中，將50μl/孔的第一抗體以2倍的濃度加入到每個(gè)含有抗原的孔中。這將使抗原的最終濃度為1毫克/毫升(10倍稀釋)和抗體濃度為 x。輕輕攪動(dòng)微量滴定板以確?；旌稀Ｖ辽倥囵B(yǎng)1.5小時(shí)。用 PBS 洗盤子。最容易做到這一點(diǎn)的方法是將盤子反復(fù)浸入裝滿 PBS 的托盤中，搖晃，然后強(qiáng)行將 PBS 扔出(扔進(jìn)水槽)。這至少重復(fù)了15次。在我們的手中，自來水往往可以是一個(gè)合適的替代洗滌介質(zhì)。加入100μl/孔的第二抗體(例如抗大鼠 IgG (整個(gè)分子)偶聯(lián)至辣根過氧化物酶(HRP) ，Sigma) ，在 BSA/PBS 中稀釋1000倍。孵育至少1.5小時(shí)。執(zhí)行上述抗體捕獲 ELISA 方案中的步驟8至13。如圖所示，確定抑制抗體結(jié)合所需的抗原濃度為50% 。B.這就是 IC50。通過比較一系列抗原的 IC50，可以很好地指示特定抗體識(shí)別這些抗原的程度。
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